特发性肺纤维化 (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF) 是一种好发于中老年人的病因未明的特殊类型的慢性进展性纤维化型疾病, 组织病理学和 (或) 影像学表现为普通型间质性肺炎。IPF的患病率和病死率逐年增加, 中位生存时间约为2～3年, 且缺乏有效治疗药物, 而早期诊断和治疗干预对于改善IPF患者预后具有重要意义[1]。IPF在古代中医学没有相应记载, 后世医家将其归为“肺萎”“肺痹”范畴, 多表现为肺虚络瘀证[2]。临床发现以病证结合模式中西医治疗IPF可有助于临床诊断, 明显改善患者生活质量及预后, 提高临床疗效[3]。随着分子生物学及系统生物学的发展, 应用现代生物组学技术从分子水平研究证候生物标志物在阐明IPF的潜在发病机制、早期诊断、治疗、预后判断及疗效评价中占有重要地位。中医证候的生物学基础研究是影响中医学发展与创新的前沿科学问题, 证候相关生物标志物干预调控网络的研究在证候规范的基础上进一步揭示证候发病病机、生物学内涵以及病机格局转变具有重要意义[4]。
病证结合生物标志物理论内涵
病证结合, 即辨病与辨证相结合的一种思维模式[5]。传统意义上的病证结合, 是指医家在辨中医之病的同时, 结合辨证施治, 以辨病为主体, 且重视辨证。然而中医病名较少, 历代文献对病名的记载不多且缺乏统一性。西医疾病诊断较中医更明确具体, 且临床运用掌握。现代病证结合借助先进的科学仪器、医学理论和思维方法确定现代医学意义上的病, 在此基础上运用中医辨证思维对其进行更加科学的辨证, 有助于提高临床诊疗水平。生物标志物是指一种具有可供客观测量和评价正常生理过程或病理过程, 或在治疗过程中体现某种特征的生化指标[6]。其作为一种辅助手段, 可用于疾病诊断, 监测疾病的发展和严重程度, 筛查高危人群等[7]。病证结合研究的关键目的是解释证候发生演变的内在机制及证候的分子生物学内涵等。中医证候的实质是多维度、多层次、多方面的复杂系统, 证候的客观存在与疾病的病理过程密切相关, 引入生物标志物的基础研究是解释证候内涵的有效手段。
构建病证结合生物标志物调控网络的方法
近年来组学技术的快速发展, 尤其是基因芯片和蛋白质组学技术为筛检IPF特异性、敏感性的生物标志物搭建了成熟平台。研究表明[8], 基因表达在正常和疾病状态时存在差异, 基因表达异常引起病理变化, 这与中医对证候本质的认识存在相似之处, 基因表达的改变正是体现了“证”的内涵。以IPF肺虚络瘀证为切入点, 结合生物信息学, 应用基因芯片技术筛选出IPF的正常组织与差异表达基因, 采用实时荧光定量PCR进行验证, 并建立IPF肺虚络瘀证基因表达谱, 构建稳定的IPF病证结合生物学调控网络, 寻找能够反映IPF相对应的替代指征——生物标志物, 研究IPF肺虚络瘀证发生的基因标志物特性及调控规律, 筛选或早期发现特异性的生物标志物, 同时也为IPF发病机制提供新的研究靶点。同位素标记相对与绝对定量技术不但能够筛选IPF相关蛋白, 同时还可以筛选特定的疾病标志物, 并对目标蛋白进行定性和定量分析[9]。另外, 表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术能够筛选IPF患者支气管肺泡灌洗液和血清中的差异蛋白, 进而应用生物信息学软件分析获得蛋白质指纹图谱, 以分析组织和血清蛋白的特异性表达, 为评价生物标志物、药物靶点的筛选和疗效监测提供参考价值[10]。组学技术的应用不仅帮助找到与IPF相关的生物标志物, 还为探索阐明IPF的形成、发生发展机制以及肺纤维化的早期诊断、防治提供新的靶点, 奠定重要的理论和实验基础。
生物标志物与IPF肺虚络瘀证
1. IPF发病机制与肺虚络瘀
广大医家将IPF归属于“肺痿”“肺痹”“络病”等范畴, 吕晓东等总结历代医家对IPF的病机认识, 结合络病理论和肺络的生理特性和生理功能, 认为IPF的核心病机为“肺虚络瘀”[11,12]。目前, IPF的发病机制并不十分明确[13], 现代研究涉及多种学说, 主要集中在细胞因子网络失衡、氧化与抗氧化失衡、损伤修复、上皮间充质细胞转化和自噬不足等学说, 主要是感染、自身免疫反应、过敏反应、缺血及血流动力学改变等诱因引起Ⅱ型肺泡上皮细胞及肺血管内皮受损 (肺络损伤) , 血小板激活、凝血亢进 (瘀) , 继而激发炎症反应 (热) , 趋化因子和细胞因子等释放, 活性氧自由基增多 (毒) , 成纤维细胞异常增殖, 大量细胞外基质聚集 (痰) , 最终导致IPF的发生, 这为阐释IPF“肺虚络瘀”病机提供了科学内涵。
2.IPF肺虚络瘀证相关生物标志物
以往认为与IPF炎症反应相关的细胞因子主要有白细胞介素4、12和肿瘤坏死因子α等。随着近年来生物组学技术的发展, 发现了与IPF肺虚络瘀证发病机制相关的新型生物标志物, 这些生物标志物可能为治疗IPF提供新靶点及思路。Ley B等[14]将生物标志物根据它们提供的信息类型分成易感性、诊断性和预后性生物标志物。易感性标志物, 通常是与疾病相关的基因突变和多态性, 识别处于IPF发展风险的患者的倾向性标志物。Alder J K等[15]研究表明, 端粒缩短是IPF发病风险增加的潜在因素。Seibold M A等[16]应用全基因组连锁扫描检测技术, 证实黏蛋白5B基因变异可能是IPF发病的危险因素, 表明其可能作为IPF的易感性生物标志物。诊断性生物标志物可区分一种疾病和另一种疾病, 协助纤维化肺病患者的诊断评估和分类。研究证实[17], 具有致肺损伤的血清生物标志物表面活性蛋白A和D (SPA和SPD) 已被评估为IPF的诊断性生物标志物。涎液化糖链抗原 (KL-6) 对肺成纤维细胞的趋化、增殖和抗凋亡作用, 提示其在肺纤维化中具有潜在的致病作用[18]。此外, 胆囊收缩素18 (CCK18) 也可能是有价值的诊断性生物标志物。预后性生物标志物是允许预测结果的标记物, 有助于评估疾病严重程度, 预测疾病进展和确定总体预后。研究发现[19], 具有刺激肺成纤维细胞胶原生成的CC趋化因子配体18 (CCL18) , 可能作为预后潜在生物标志物, 并用于患者的发展评估。Richards T J等[20]在探索性和验证性队列研究中发现, 血浆基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP) 浓度作为变量建立个人病死率预测指数, 提示MMP可能是潜在的预后性生物标志物。此外, 人软骨糖蛋白-39 (YKL-40) , 循环的纤维细胞, CXC趋化因子配体13, 血管内皮生长因子等可能也是与IPF生存率相关的预后生物标志物。
构建病证结合 (IPF肺虚络瘀证) 生物标志物的价值
1.病证结合生物标志物揭示IPF肺虚络瘀证发病病机基础
病证结合将中西医两种医学体系交叉融合, 其实质是将疾病概念体系与证候概念体系相结合, 证候是以辨证思维为主导的病证结合的具体体现。中医证候病机学理论是基于中国传统意象思维方式, 总结和概括对机体整体功能反应状态的发生、发展变化与转归的规律性认识, 以“证候病机”为主要表述形式[21]。按西医疾病 (IPF) 的发展规律进行中医证 (肺虚络瘀证) 的诊断, 吸收并结合现代生物标志物研究成果的模式正在逐步走向主导地位。IPF肺虚络瘀证的关键机元 (构成病机的独立功能单位) 在于“痰”“热”“毒”“瘀”, 肺虚日久, 致肺阴虚火热, 煎熬津血, 为痰为瘀, 邪气渐积, 瘀久生毒, 形成痰热瘀毒互结之格局。炎症反应引发“热”的病机, 是“热”的物质基础, 活性氧自由基增多导致“毒”的形成, 高凝状态及持续纤维蛋白沉积是导致“瘀”形成的重要因素, 刘勇明等[22]亦认为凝血—纤溶系统失衡与“瘀”的发生高度相关。肺纤维化发生时, Ⅱ型肺泡上皮细胞大量再生, 肺损伤相关的血清生物标志物, 如SPA和SPD合成增加, 血管破裂和血溶物外渗, 导致血液凝滞, 这与中医“瘀”的内涵有着异曲同工之妙。研究发现[23], 通过调控MMPs/TIMPs系统等相关机制能够改善炎性细胞浸润和纤维组织的增生, 从而抑制细胞外基质 (“痰”) 的沉积。基于病证结合生物标志物思路, 有望对IPF肺虚络瘀证发病病机的科学内涵进一步认识。
2. 病证结合生物标志物揭示IPF肺虚络瘀证生物学内涵
随着分子生物学与系统生物学的发展, 基于生物网络病证结合的方法从基因、蛋白等分子生物学水平辩证地研究机体整体功能和联系, 借助系统生物学相关技术 (基因组学、蛋白组学) , 期望通过对生物标志物的测定获知机体当前所处的生物学进程, 揭示证候的生物学基础, 是研究证候生物学内涵的新思路。生物标志物在对IPF的鉴别诊断和辨证分型上亦有不可或缺的作用[24], 例如端粒酶基因突变时, 除了IPF也可以表现间质性肺炎的其他类型, 应用基因芯片技术对IPF肺虚络瘀证进行研究, 从基因表达谱可以了解IPF与间质性肺炎的其他类型及肺虚络瘀证与其他证候之间的基因差异表达, 进而深入了解IPF肺虚络瘀证在基因水平的生物学本质。宋磊等[25]应用蛋白质组学技术检测IPF患者和特发性非特异性间质性肺炎患者肺SPA外周血浆中的水平, 并以酶联免疫吸附法验证血浆该蛋白质谱的差异表达, 发现SPA在IPF患者外周血浆中表达上调, 表明其可作为IPF和特发性非特异性间质性肺炎鉴别诊断的血浆生物标志物。目前蛋白质组学技术已应用于各个领域, 但在病证结合生物标志物方面的研究较少, 开拓应用蛋白质组学技术研究IPF血清蛋白, 如KL-6、SPA、SPD、MMP-1、MMP-7、CCK-18、YKL-40等血清标志物, 分析细胞内动态变化的蛋白质组分、表达水平和修饰状态, 差异蛋白的表达以展现IPF肺虚络瘀证的多样性及个体差异性, 从分子生物学角度研究并探讨蛋白质调控网络的肺虚络瘀证的发生、发展及转化等应是广大研究者拟解决的关键问题。
3. 病证结合生物标志物揭示IPF肺虚络瘀证病机格局转变
IPF多属虚实夹杂之证, 本虚标实居多, “虚”包括气虚、阴虚、阳虚等, “实”包括痰、热、瘀、毒等, 缓解期以“肺虚络瘀”为基本病机, IPF患者久病体虚致其肺络营血不足, 气络失和, 血络失荣, 进一步损耗肺气, 而出现IPF急性发作, 故此吕晓东教授等[26]根据络病理论和肺络的结构功能特点及IPF的临床表现, 总结并提出其急性发作期的根本病机为“肺热络瘀”。近年来, 人们发现少数IPF患者在缓解期或缓解期过后突然出现不明原因的急性呼吸功能恶化, 因而IPF的发展过程可能不是渐进性的, 而是存在急性加重的情况。特发性肺纤维化急性加重 (acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis, AE-IPF) 的发病机制尚不明确, 但目前大多数人认为可能是由于大量炎性细胞因子如IL-8, TGF-β等刺激成纤维细胞增殖和胶原分泌增多, 也可能是与相关基因突变导致的端粒酶变异有关[27], 造成肺泡上皮细胞修复功能下降, 从而促使AE-IPF的发生发展。Collard H R等[28]研究显示, 血清KL-6、SPD、血管性血友病因子、IL-6、总蛋白C、血栓调节蛋白和纤溶酶原激活物抑制剂-1的含量在IPF急性期时要明显高于稳定期。其他生物标志物包括高迁移率族蛋白1、单核细胞趋化蛋白-1、可溶性ST2蛋白、α-防御素或CCNA2基因可能是预测AE-IPF风险的候选标志物。虽然这些生物标志物可能预测AE-IPF的发生, 但仍没有特异性生物标志物能够清楚地显示出AE-IPF发病的预测效用。
小结
综上所述, 基于病证结合生物标志物思路, 通过基因芯片或蛋白质组学等技术筛选获得肺间质纤维化差异表达基因或蛋白, 构建分子生物学调控网络, 以期发现早期特异性的生物标志物, 结合PCR验证的分子生物学技术引入证候生物标志物基础研究, 从分子水平揭示IPF肺虚络瘀证发病病机、生物学内涵以及病机格局转变, 以体现构建病证结合生物标志物理论体系的价值。但目前研究显示[29], 单一生物标志物在其诊断、病情评估、预后及判断方面作用有限, 随着今后生命科学的发展和相关技术的突破, 相信越来越多的生物标志物将被发现、验证, 用以揭示疾病证候本质, 病证结合生物标志物诊疗模式也将更多地应用于临床实践, 从而降低IPF患者的病死率。
来源：中华中医药杂志 作者：郑钰 吕晓东 庞立健 刘创 刘勇明 刘妍彤 张浩洋