每年有多达50万人罹患脊髓损伤 (Spinal cord injury, SCI) , 对于他们来说, 伤害将会改变一生, 脊髓是中枢神经系统的组成部分, 周围神经系统的神经纤维从它发出, 向肌肉和器官传递信号, 使人们能够运动、感觉到热和疼痛, 但与周围神经不同, 中枢神经系统损伤后很难恢复[1]。所以对于脊髓损伤后的治疗一直是医学界的难题。但中医治疗体现了特殊优势, 电针广泛应用于多种疾病的辅助治疗, 尤其是脊髓损伤等神经系统疾病。但其分子生物学机制并不十分明确。综述近年学者们对电针治疗脊髓损伤的实验机制研究文献, 总结电针治疗SCI的分子生物学机制, 综述如下。
1 电针促进神经修复
1.1 促进轴突再生
1.1.1 电针抑制轴突生长抑制因子表达
在抑制神经轴突生长中, 几种髓鞘成分, 包括Nogo-A (Nogo-66) 、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白 (OMgp) 和髓鞘相关糖蛋白 (MAG) 的细胞外结构域, 通过相同的Nogo受体 (NgR) 发挥作用[2]。研究证明电针在治疗脊髓损伤时降低Nogo-A、NgR、OMgp的表达[3,4], 说明电针可以抑制轴突生长抑制因子的含量, 从而促进神经元轴突的生长, 进而改善大鼠后肢的运动功能。
1.1.2 电针减少胶质瘢痕的形成
胶质瘢痕的主要细胞成分是反应性星形胶质细胞 (以胶质原纤维酸性蛋白GFAP为主要标志物) 。胶质瘢痕是轴突再生的物理和分子屏障, 抑制损伤轴突再生, 并已成为脊髓损伤再生研究的重要靶标[5]。BMP-2是骨形态发生蛋白, 能够增强星型胶质细胞的增生, 促进胶质瘢痕的形成, 抑制神经再生并阻止神经功能的恢复。研究发现电针降低脊髓损伤GFAP和BMP-2表达量, 改善大鼠运动功能[6,7]。
1.1.3 电针促进轴突再髓鞘化
SCI后会出现轴突脱髓鞘的病理改变, 促进轴突再髓鞘化有利于修复神经纤维的传导功能, 促进损伤脊髓的修复。少突胶质细胞分泌的髓鞘碱性蛋白 (Myelin basic protein, MBP) 是轴突再髓鞘化的重要蛋白。电针能升高损伤脊髓细胞MBP表达, 增进轴突再髓鞘化, 改善大鼠运动功能[8]。
1.2 促进神经元再生
1.2.1 电针促进神经干细胞分化
在成年哺乳类动物中枢神经系统中, 神经干细胞 (Neuralstem cells, NSCs) 在受损情况下具有分化功能, 可分化成神经元[9]。电针可促进SCI后骨髓间充质干细胞 (MSCs) 的分化和神经纤维的再生, 使神经纤维再生和部分功能恢复[10]。巢蛋白 (nestin) 是神经干细胞标志性蛋白。电针可以升高巢蛋白的表达, 促进神经干细胞的分化和运动功能的恢复[6]。
1.2.2 电针促进神经元的生长
生长相关蛋白43 (GAP-43) 是参与神经元生长和突触再生的胞膜磷酸蛋白质, 是中枢神经再生的标志性蛋白。电针促进GAP-43表达增高可以促进锥体再生和突触形成, 重建神经传导通路[11]。
2 电针抑制细胞凋亡
细胞凋亡的形态变化包括染色质凝聚, 核膜破裂, 细胞皱缩和细胞表面附近的小泡囊体的形成, 称为凋亡小体[12]。神经细胞凋亡是脊髓继发性损伤病理机制之一[13], 抑制神经元细胞凋亡可有效促进损伤脊髓恢复。李晓宁等[14]研究发现, 夹脊电针可以在治疗3天时明显抑制大鼠脊髓损伤后的神经细胞凋亡, 且随着治疗时间的增加抑制凋亡的作用越明显, 大鼠后肢运动功能也随着治疗时间的增加而明显恢复。有学者研究, 电针能通过增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达、抑制促凋亡蛋白Caspase-3、Bax、PARP的表达, 从而抑制脊髓神经元细胞的凋亡[15]。尹洪娜等[16,17]研究夹脊电针可以抑制内质网应激相关因子Caspase-12、CHOP, 从而抑制细胞凋亡。
3 电针改善损伤区域微环境
3.1 电针抑制炎症反应
在脊髓继发性损伤阶段浸润性白细胞 (嗜中性粒细胞和巨噬细胞) 和先天免疫细胞 (小胶质细胞和星形胶质细胞) 活化引起损伤区全面炎症级联反应。这些炎症细胞大量释放促炎细胞因子 (IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ等) 和趋化因子 (CXCL1, CXCL12等) , 导致轴突和神经元的损伤[18]。巨噬细胞/小胶质细胞是脊髓损伤部位的重要效应细胞。根据细胞表面标记可将巨噬细胞分为M1亚型和M2亚型, CD86和CD206分别针对M1和M2亚型。M1型巨噬细胞在创伤急性反应过程中通过增加吞噬功能和释放促炎细胞因子 (如白细胞介素1L-1β、IL-6和TNF-α) , 促进天然免疫, 清除损伤部位的外来微生物和伤口碎片。M2型巨噬细胞表现出组织修复特性并减弱促炎细胞因子的产生, 促进抑炎因子1L-10的分泌[19,20,21]。在脊髓损伤中, 炎症免疫反应可以说是一把双刃剑, 对于M1和M2型巨噬细胞尤其如此, 一般来说, M1是有害的, 而M2是保护性的。调节M1和M2巨噬细胞的极化可能影响炎症应答[22,23]。电针可以抑制M1巨噬细胞极化, 显著降低CD86的表达, 抑制促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α的分泌, 促进M2型巨噬细胞的极化, 显著升高CD206的表达, 促进抑炎因子IL-10的分泌, 减轻炎症反应[24]。危险信号是许多常见炎症疾病的标志, 这些刺激可以激活细胞内天然免疫信号受体NLRP3, 一旦激活, NLRP3就开始组装炎性体, 导致半胱氨酸蛋白酶-1 (caspase-1) 介导的白细胞介素-1β (IL-1β) 细胞因子家族的蛋白水解活化, 并诱导炎性细胞凋亡性细胞死亡[25]。有研究表明NLRP3炎性体是小鼠脊髓继发性损伤的重要原因[26]。而夹脊电针可以降低NLRP3的表达, 改善损伤脊髓区的微环境, 利于大鼠运动功能恢复[27]。
3.2 电针抑制兴奋性氨基酸毒性
谷氨酸是中枢神经系统中的主要兴奋性递质, 当其在突触间隙中的浓度异常增加时可能产生细胞损伤[28], 在脊髓损伤时, 兴奋性神经递质谷氨酸被释放并保留在突触间隙中, 引起突触后神经元中的钙进入和去极化, 这些神经元持续暴露于兴奋性毒性状态[29]。N-甲基-D-天门冬氨酸 (N-methyl-D-aspartate, NMDA) 受体是一种离子型谷氨酸受体, 其过度刺激增强细胞内钙浓度和神经元兴奋性毒性[30]。Tu WZ等[31]应用督脉电针减低脊髓损伤后NMDA受体亚单位NR1和NR2蛋白表达, 减轻神经元兴奋性氨基酸毒性, 促进大鼠后肢功能恢复。
3.3 电针抑制脂质过氧化反应
脊髓损伤后, 活性氧簇 (ROS) 大量积聚, 清除能力不足, 过量的活性氧簇启动不饱和脂肪酸级联反应, 破坏神经元细胞膜, 称为脂质过氧化反应。其中丙二醛 (MDA) 是过氧脂质的代谢产物, 超氧化物歧化酶 (SOD) 是自由基的清除剂。电针降低MDA的含量、升高SOD的含量, 从而抑制脊髓组织的脂质过氧化反应[32]。
3.4 电针促进神经营养因子分泌
神经营养因子是一类与伸进元存活密切相关的蛋白质, 神经营养因子被鉴定为神经元存活的启动子, 但人们认识到它们对神经元发育和功能的许多方面都有调节作用, 包括突触形成和突触可塑性。在哺乳动物中表达4种神经营养因子:神经生长因子 (Nerve growth factor, NGF) 、脑源性神经营养因子 (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 、神经营养蛋白-3 (NT-3) 和神经营养蛋白-4 (NT-4) [33]。脊髓损伤后神经元受损, 因此, 神经营养因子和脊髓损伤功能恢复密切相关[34]。督脉电针对NT-3、NGF和BDNF有上调作用[34,35], 证明电针可以促进神经营养因子分泌, 防止脊髓组织神经元的大量死亡, 有利于大鼠后肢功能康复。
表1 电针作用机制及相关因子变化
3.5 电针增加血流量, 改善微循环
血小板活化因子 (PAF) 在SCI时大量增加, 促进损伤区和临近组织微血管血栓的形成, 同时刺激微血管收缩, 导致血流量的减少[36]。王延雷等[37]研究督脉电针抑制PAF的释放, 促进脊髓血流量增加, 修复损伤脊髓, 吴永刚等[38]研究在脊髓损伤早起, 损伤区脊髓血流量 (SCBF) 逐渐下降, 24 h后逐渐恢复, 应用夹脊电针治疗后, 在2 h、4 h、8 h时明显增加损伤区血流量, 在4 h时最为明显, 说明电针在SCI后2～8 h影响脊髓血流量。
3.6 电针促进自噬流
自噬流包含了整个自噬过程, 包括了自噬结构的形成, 底物向溶酶体的运送, 以及底物的降解和大分子物质释放回细胞质的整个流程[39]。LC3-II是自噬体的标记蛋白, p62是一种衔接蛋白, 可将泛素化的蛋白导向自噬体进行降解。随着p62与其蛋白一起降解, 当自噬通量增加时, 其蛋白质水平降低;相反, 当自噬流被抑制时, p62水平增加。急性挫伤SCI大鼠LC3-II和p62的伴随积累, 表明自噬流的抑制[40]。夹脊电针可以升高LC3-II的含量, 降低p62蛋白含量, 增加脊髓组织自噬流, 从而控制神经细胞凋亡[41]。
4 小结
电针促进脊髓损伤的修复在临床中已经得到证实, 患者往往在慢性期就诊进行电针治疗, 在动物实验中电针在急性期治疗有不错的效果, 可以多尝试在临床中应用。临床中常用的电针手法有督脉电针和夹脊电针。其治疗脊髓损伤的分子机制主要为促进神经修复、抑制神经细胞凋亡、改善脊髓损伤区域微环境。促进神经修复包括抑制轴突生长抑制因子的表达, 减少瘢痕组织的形成, 促进神经干细胞分化和神经元再生。改善脊髓损伤区域微环境包括抑制损伤区域免疫炎性反应、脂质过氧化反应和兴奋性氨基酸毒性, 增加神经营养因子的分泌和血流量, 改善微循环, 增强脊髓损伤区自噬流。具体机制及相关因子改变总结如表1。以上分子机制不是孤立的, 是互相联系和影响的, 改善微环境的最终目的是防止神经细胞的死亡和促进神经元再生、轴突和髓鞘重塑, 改善脊髓损伤后的运动功能, 而微环境内部之间的影响因素又是相关联的。例如在脊髓中度损伤时导致细胞内溶酶体的损伤, 自噬体不能通过溶酶体降解, 细胞内自噬体大量堆积, 自噬体包裹损伤的线粒体等细胞器, 受损的线粒体释放大量的活性氧簇 (ROS) , ROS促使线粒体膜上生成小孔, 膜电位下降, 凋亡因子外流, caspase级联反应, 导致细胞凋亡。ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质引起脂质过氧化反应形成脂质过氧化产物, 从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变, 最终导致细胞结构和功能的改变, 导致细胞凋亡和坏死。目前, 研究脊髓损伤神经细胞死亡方式最多的是细胞凋亡, 但是其它神经细胞死亡方式逐渐被发现, 例如以RIPK1-RIPK3-MLKL坏死复合物为主的坏死性凋亡Necroptosis、铁死亡Ferroptosis、炎性小体NLRP3介导的细胞焦亡Pyroptosis等[42], 抑制细胞凋亡并不能完全改善脊髓损伤后的运动功能。有研究认为, 用抗凋亡泛抑制剂Z-VAD-FMK会将凋亡的细胞转向坏死性凋亡[43,44], 以坏死性凋亡的方式死亡, 而Z-VAD-FMK结合坏死性凋亡抑制剂NEC-1可同时抑制两种细胞死亡[45], 电针治疗脊髓损伤分子机制是多靶点的, 在抑制细胞凋亡的同时是否还抑制坏死性凋亡等其它细胞死亡方式, 是在电针治疗SCI分子生物学领域中继续研究的方向。
来源：针灸临床杂志 作者：孙忠人 田洪昭 徐思禹 赵健宏 栾逸先 张文钊 尹洪娜