穴位的作用与脏腑和经络有密切的关系，主要表现在反应病症以协助诊断以及接受刺激以防治疾病两个方面。
《灵枢·邪客》说：“肺心有邪，其气留于两肘；肝有邪，其气留于两腋；脾有邪，其气留于两髀；肾有邪，其气留于两胭”。《类经》注说：“凡病邪久留不移者，必于四肢八溪之间有所结聚，故当于节之会处索而刺之”，这说明穴位在病理状态下具有反应病候的作用。如有胃肠疾患的人常在足三里，地机等穴位上出现压痛或过敏，有时还可在第五至第八胸椎附近触摸到软性异物；患有肺病的人，常可在肺俞、中府等穴位处有压痛、过敏及皮下结节。因此，实践中常用指压背俞穴、募穴、郄穴、原穴的方法，察其穴位的压痛、过敏、肿胀、硬结、凉热，以及局部肌肉的坚实软硬程度，并观其皮肤的色泽、瘀点、丘疹、脱屑，以及肌肉的隆起或凹陷等来协助诊断，这就是《灵枢·官能》所说的：“察其所痛，左右上下，知其寒温，何经所在”，《灵枢：刺节真邪》又说：“用针者，必先察其经络之虚实，切而循之，按而弹之，视其应动者，乃后取之而下之”。
近几年来，在利用穴位协助诊断方面又有新的发展，如耳廓中耳穴的测定，对原穴用导电量的测定，对十二井穴用知热感度的测定等，通过仪器对这些穴位的探测，可以在一定程度上反应经络、脏腑、组织器官的病变，为协助诊断增添了新的内容。
《素问·五脏生成篇》说：“人有大谷十二分，小溪三百五十四名，少十二俞，此皆卫气所留止，邪气之所客也，针石缘而去之”，指出穴位不仅是气血输注的部位，也是邪气所客之处所，又是按摩和针灸防治疾病的刺激点。穴位防治疾病的关键就是接受适当的刺激以通其经脉，调其气血，使阴阳归于平衡，脏腑趋于和调，从而达到扶正祛邪的目的。穴位防治疾病的作用可以体现在以下三个方面：
1．近治作用。这是一切穴位(包括十四经穴、奇穴、阿是穴)主治作用所具有的共同特点，这些穴位均能治疗该穴所在部位及邻近组织、器官的病症，如眼区的睛明、承泣，四白等穴位，均能防治眼病；耳区的听宫、听会、耳门等穴位，均能防治耳病；胃部的中脘、建里、梁门诸穴，均能治疗胃病等。
2．远治作用。这是十四经穴位主治作用的基本规律。在十四经穴位中，尤其是十二经脉在四肢肘，膝关节以下的穴位，不仅能治疗局部病症，而且还能治本经循行所涉及的远隔部位的组织、器官、脏腑的疾病，有的甚至具有影响全身的作用。如合谷穴，不仅能治上肢病症，而且能治颈部和头部的疾病，同时还能治外感病的发热；足三里穴不但能治疗下肢疾病，而且对调整消化系统的功能，甚至对提高身体免疫力等方面都具有很大的作用。
3．特殊作用。实践证明点按、针刺某些穴位，对机体的不同状态，可起到双重性的良性调整作用。如泄泻时，针刺天枢穴能止泻；便秘时，针刺天枢穴又能通便。心动过速时，针刺内关穴能减慢心率；心动过缓时，针刺内关穴又可使之恢复正常。此外，穴位的治疗作用还具有相对的特异性，如大椎穴退热，至阴穴矫正胎位等，均为其特殊的治疗作用。