针刺对营养性肥胖小鼠肠黏膜TLR1/TLR2基因的良性调控作用
肥胖症已成为全球公共卫生难题, 是诸多疾病高发危险因子 (如糖尿病、高脂血症、高血压病等) , 其病因机制研究热点目前集中在脂质代谢异常及慢性炎性反应方面[1,2]。肥胖形成发展过程中, 肠黏膜免疫存在明显功能紊乱, 慢性炎性反应显著高于其他组织[3]。Toll样受体 (Toll-like receptor, TLRs) 是介导肠黏膜炎性反应的关键调控家族因子之一, 在肥胖肠黏膜慢性炎症中, 针对脂质代谢紊乱和慢性炎性反应, TLR1和TLR2两个受体因子表达异常活跃[4]。所以, 课题组重点研究肥胖形成、发展、治疗过程中, 相关脂质代谢及TLRs受体变化及良性调控的机制。
针刺是中医学的特色疗法[5]。肥胖症中医病机“多虚、多痰”[6], 常采用健脾、益气、祛痰的指导原则, 课题组据此选择针刺中脘、关元、天枢、足三里4个穴位, 施以健脾益气补法治疗, 效果较好, 现将研究成果报告如下。
材料
1.动物
100只SPF级C57BL/6小鼠, 8周龄, 雌雄各半, 体质量 (18±2) g, 购买于成都达硕生物科技有限公司, 合格证编号:SCXK (川) 2013-24。饲养于贵阳中医学院针灸推拿学院实验中心动物房内, 温度23～25℃, 湿度40%～60%, 昼夜各半, 7:00～19:00开灯, 19:00～7:00关灯。
2.试剂
白介素-6 (interleukin-6, IL-6) ELISA试剂盒 (依科赛生物科技有限公司, 批号:21F011) , 白介素-10 (interleukin-10, IL-10) ELISA试剂盒 (依科赛生物科技有限公司, 批号:21F008) , 肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) ELISA试剂盒 (依科赛生物科技有限公司, 批号:21F008) , TLR1兔多克隆抗体 (英国abcam-艾博抗贸易有限公司, 批号:ab37068) , TLR2兔多克隆抗体 (英国abcam-艾博抗贸易有限公司, 批号:ab62566) , SuperReal PreMix Plus试剂盒 (天根生物科技有限公司, 批号:P4224) ;FastQuant RT Kit试剂盒天根生物科技有限公司, 批号:P4119) 。
3.仪器
全波长多功能酶标仪 (型号:VarioskanTM, 美国ThermoFisher) , 超微量紫外-可见光分光光度计 (型号:NanoVue Plus, 英国Biochrom公司) , 快速核酸提取仪 (型号:FastPrep-24, 美国MP Biomedicals公司) 。
方法
1.造模
将C57BL/6小鼠适应性喂养1周后, 通过随机数字表随机选取10只为正常组, 余下90只饲以高脂饮食, 高脂饲料购买于北京华阜康生物科技股份有限公司, 合格证编号:SCXK (京) 2014-0008。每周定时测定小鼠体质量、体长等指标, 8周后, 筛选体质量>对照组均值20%, 且Lee’s指数显著高于正常组的小鼠, 作为肥胖鼠。
2.针刺
将30只肥胖鼠, 按照随机数字表将其随机均分成模型组、针刺14d组和针刺28d组, 每组10只。选择中脘、关元、天枢、足三里4个穴位, 参照2016年版《实验针灸学》[7]。针刺操作, 用固定器固定小鼠, 消毒, 使用32号无菌针灸针针刺。中脘斜刺4mm, 关元穴斜刺5mm, 天枢斜刺4mm, 足三里直刺3mm, 施以补法, 行搓针手法, 先实搓再虚搓, 得气后 (以局部轻微抖动为度) , 留针10min, 日1次, 左右侧轮换取穴。正常组及模型组以相同方式固定10min, 但不针刺治疗。
3.取材
治疗结束后禁食12h, 股动脉取血, 分离血清。选取肠中段带有派氏淋巴小体 (Peyer’s patch, PP) 的1cm肠段3份, 1份检测组织相关炎性因子的差异变化, 1份固定于10%甲醛溶液中, 检测TLR1及TLR2的密度分布, 1份检测TLR1及TLR2的基因表达情况。
4.检测方法
按照ELISA试剂盒操作说明, 测定各组小鼠血清瘦素 (leptin, LP) 、脂联素 (adiponectin, ADPN) 及肠组织炎性因子 (IL-6, IL-10及TNF-α) 的差异变化, 应用免疫组织化学方法 (immunohistochemistry, IHC) 检测肠PP中TLR1及TLR2的分布密度, 400倍电镜下观察, 比较光密度差异。利用Trizol法提取组织总RNA, 通过逆转录方式及TLR1 (F:5’-TAC AGT TCC TGG GGT TGA GC-3’;R:5’-ATT CGG GGT CTT CTT TT TCC-3’) 和TLR2 (F:5’-GTG TCT GGA GTC TGC TGT GC-3’;R:5’-GCT TTC TTG GGC TTC CTC TT-3’) 的引物, 检测样本中TLR1及TLR2基因表达。
5.统计学方法
使用SPSS 19.0统计软件进行分析, 计量数据采用±s表示, 单因素方差分析, 组间配对S-N-K检验, P<0.05为差异具有统计学意义。
结果
1.针刺对各组实验鼠治疗前后体质量及Lee’s指数的影响
见表1。干预前模型组和针刺各组体质量及Lee’s指数显著高于正常组 (P<0.01) ;针刺治疗后, 针刺各组体质量及Lee’s指数显著低于模型组 (P<0.01) ;与针刺14d组比较, 针刺28d组Lee’s指数明显降低 (P<0.05) 。
表1 各组小鼠干预前后体质量及Lee’s指数的变化 (±s, n=10)
注:与正常组同期比较, *P<0.05, **P<0.01;与模型组同期比较, △P<0.05, △△P<0.01;与针刺14d组同期比较, ▲P<0.05。
2.针刺对各组小鼠血清LP及ADPN的影响
见表2。模型组血清LP、ADPN含量显著高于正常组 (P<0.01) , 针刺后, 针刺各组LP、ADPN含量显著低于模型组 (P<0.05, P<0.01) , 针刺28d组明显低于针刺14d组 (P<0.05) 。
表2 各组小鼠血清LP及ADPN的含量变化 (±s, n=10, ng/mL)
注:与正常组比较, *P<0.05, **P<0.01;与模型组比较, △P<0.05, △△P<0.01;与针刺14d组比较, ▲P<0.05。下表同。
3.针刺对各组小鼠肠黏膜组织中IL-6、IL-10及TNF-α的影响
见表3。模型组PP中IL-6、IL-10及TNF-α含量显著高于正常组 (P<0.01) ;针刺各组显著于模型组 (P<0.01) ;与针刺14d组比较, 针刺28d组降低明显 (P<0.05) 。
表3 各组小鼠肠中段PP中IL-6、IL-10及TNF-α含量变化 (±s, n=10, pg/mL)
4.针刺对各组小鼠肠黏膜中TLR1及TLR2蛋白分布密度及基因表达差异的影响
通过IHC检测肠中段PP中TLR1蛋白分布密度 (图1e) , 模型组 (0.1837±0.0215) 显著高于正常组 (0.1442±0.0084) (P<0.01) , 针刺后明显低于模型组 (P<0.05) ;针刺组之间无显著差异。RT-PCR检测TLR1基因表达结果显示 (图1f) , 模型组TLR1基因相对表达量显著高于正常组 (P<0.01) , 针刺各组明显降低 (P<0.05) 。
通过IHC检测肠中段PP中TLR2蛋白分布密度 (图2e) , 模型组 (0.3023±0.0141) 均显著高于正常组 (0.2371±0.0075) (P<0.01) ;针刺各组明显低于模型组 (P<0.05) , 针刺28d组的TLR2分布密度明显低于针刺14d组 (P<0.05) 。RT-PCR检测TLR2基因表达结果显示 (图2f) , 模型组TLR2基因相对表达量显著高于正常组 (P<0.01) , 与模型组比较, 针刺各组明显降低 (P<0.01) 。
图1 TLR1蛋白分布 (IHC×400) 及基因表达差异
注:a.正常组;b.模型组;c.针刺14d组;d.针刺28d组;e.TLR1蛋白分布密度;f.TLR1基因相对表达量。与正常组比较, **P<0.01;与模型组比较, △P<0.05。图中箭头标注处是TLR1蛋白被染色后阳性反应, 是差异较为显著区域。
图2 TLR2蛋白分布 (IHC×400) 及基因表达差异
注:a.正常组;b.模型组;c.针刺14d组;d.针刺28d组;e.TLR2蛋白分布密度;f.TLR2基因相对表达量。与正常组比较, *P<0.05, **P<0.01;与模型组比较, △P<0.05, △△P<0.01;与针刺14d组比较, ▲P<0.05。图中箭头标注处是TLR2蛋白被染色后阳性反应, 是差异较为显著区域。
讨论
肥胖脂肪组织分泌脂肪激素代谢异常[8,9], 其中LP及ADPN变化明显, 引起脂肪合成及脂肪堆积, 通过活化肌肉组织中腺苷酸激活蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase, AMPK) 途径及过氧化物酶体增殖物激活受体α (peroxisome proliferator activated receptor-α, PPAR-α) , 增加脂肪酸氧化及外周葡糖糖摄取, 抑制脂肪脂质代谢[10]。针刺调节LP及ADPN激活AMPK及NF-κB途径, 改善脂质紊乱。慢性炎性反应使脂肪组织微循环通透性增加, 破坏内皮细胞功能稳定, 促进肠黏膜免疫紊乱。研究表明[11], 肥胖存在固有免疫和获得性免疫紊乱现象, 脂肪细胞分泌促炎性因子及脂代谢相关的关键性因子。营养性肥胖诱导、触发部分炎性反应, 激活NK-κB等信号通路, 调节c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal protein kainse, JNK) 和蛋白激酶R等关键因子, 下调PPAR-γ活性[12]。实验结果表明肥胖鼠肠黏膜PP上IL-6、IL-10、TNF-α含量增加, 针刺补法后显著改善, 降低慢性炎性反应。
TLRs通过病原体相关识别受体模式 (pathogen-associated molecula pathogen-associated molecular patterns, PAMP) 识别受体、判断致病菌, 启动防御机制, 是天然免疫重要组成[13]。TLRs上调抗原提呈细胞表面的共刺激分子, 促进炎性因子分泌, 调节获得性免疫。TLR1介导肠代谢产物三酰甘油酯调节, 参与肠道脂质代谢, 有效提升短链脂肪酸利用率[14]。TLR2识别抗原并将抗原的信号传递给免疫系统的细胞, 通过肽聚糖及脂多糖, 上调细胞膜上TLR2基因表达, 引起局部肠壁细胞通透性增加[15], 维持肠道黏膜的稳定功能, 对肠黏膜免疫作用重大, 时刻维持肠黏膜屏障免疫功能的可塑性。实验结果显示肥胖鼠肠道肠壁上TLR1蛋白分布密度增加, 基因相对表达量升高, 在经过针刺治疗后, 逐步恢复, 降低肠黏膜的TLR1蛋白分布及表达, 促进机体脂肪消耗, 达到减肥降脂目的。实验中这两种TLRs蛋白在肥胖鼠肠黏膜分布呈现高表达状态, 针刺治疗后, 呈现回落现象。对肠道TLRs的整体观察分析得知, 肥胖鼠肠黏膜上TLRs基因相对表达量呈现TLR1及TLR2的基因相对表达量增加, 表明肥胖逐步形成过程中, 由于慢性炎症的递进式进展, 诱使肠黏膜免疫功能出现紊乱, 引起TLRs介导炎性反应过程进一步恶化, 加重慢性炎性反应。通过针刺治疗, 疏通经络, 调整机体免疫功能, 消除肠黏膜免疫紊乱, 使得慢性炎症自消。
课题创新点为运用炎症诱导经典机制, 探究针刺调节肠道黏膜免疫的效应机制, 通过研究炎症应答调节的关键蛋白TLR1及TLR2, 揭示针刺调整肠黏膜免疫的应答机制, 为针刺减肥的深入机制的研究提供科学依据。
综上, 肥胖形成伴随慢性炎性反应, 激活炎性反应TLRs介导信号通路, 使得肠黏膜上TLRs蛋白分布密度改变, 肠道内壁通透性增加, 诱使肠黏膜免疫系统及脂质代谢紊乱, 通过针刺补法, 健脾、益气、祛痰等方式可以有效改善这一状态, 取得较佳治疗效果。
来源：中华中医药杂志 作者：司原成 苗维纳 吴高鑫 陈波 丁维俊