穴位是古人在长期的医疗实践中陆续发现的。远在新石器时代，我们的祖先就已经使用砭石来割刺放血，割治脓疡；或按压、叩击、热熨体表；或在体表某一部位用火烤、烧灼等方法来减轻和消除伤痛。久而久之，人们逐渐意识到人体的某些特殊部位具有治疗疾病的作用，这就是穴位发现的最初过程。
早期人们只是在病痛的局部作为刺灸的部位，即“以痛为腧”。当时既没有固定的部位，也无所谓穴名。后来随着医疗经验的积累，才把某些特殊的“按之快然”、“驱病迅捷”的部位称为“砭灸处”。例如扁鹊治虢太子尸厥，取“三阳五输”；马王堆汉墓《帛书·脉法》中说的“阳土于环二寸而益为一久(灸)”；《五十二病方》中“久(灸)中指”等，其所指的都是刺灸的部位，这说明早在战国初期已经形成了穴的概念。又经过长期大量的医疗实践，人们对穴位的部位特点和治疗范围的认识便深入一步，不仅确定了位置，明确了主治，并赋予了名称，以后又进行了系统的分类。
我国最早的中医典籍《黄帝内经》(简称《内经》)一书，系统地论述了穴位的位置、名称、分经、主治等内容，从而为腧穴学的形成和发展奠定了基础。其后的又一典籍《黄帝八十一难经》(简称《难经》)又提出了八会穴，并对俞募穴、原穴、五输穴均有所阐发。晋代中医家皇甫谧根据《素问》、《针经》、《明堂孔穴针灸治要》编纂而成的《针灸甲乙经》(简称《甲乙经》)，这是我国现存最早的针灸专著。全书共一百二十八篇，其中七十余篇专讲穴位方面的内容，对穴名、别名、位置、取法、主治等都作了全面的论述。并对穴位的顺序进行了整理，头面躯干以分区划线排列，四肢以分经排列。因此，该书集晋代以前针灸学的大成，为腧穴学理论实践的发展做出了重大贡献。
唐代中医家孙思邈著《备急千金要方》和《千金翼方》各三十卷，发展了腧穴的配伍，并收集了大量的经外奇穴，以及便于实践的足三里穴保健灸等，扩大了穴位防治疾病的范围。宋代医家王惟一撰写《铜人腧穴针灸图经》三卷，详载穴位的名称、部位、主治、刺灸等内容，并绘有十二幅十二经穴图谱，由当时官府刊行。翌年铸成两具腧穴铜人模型作为教具，为学习点穴针灸提供了方便，给后世针灸教学树立了典范。元代医家滑伯仁著《十四经发挥》三卷，始将任、督二脉与十二经脉合称为十四经，并把全身经穴按《灵枢·经脉》循行顺序排列，称为“十四经穴”。明代针灸家杨继洲著写《针灸大成》十卷，汇集了明代以前针灸医籍中的精华，是一部总结性的著作。清代针灸不如明代昌盛，鸦片战争以后，针灸日趋衰落。中华人民共和国成立以后，随着祖国医学事业的发展，按摩、针灸也受到了应有的重视；中医工作者对穴位的作用以及一些规律性联系等各个方面都进行了大量的临床和实险研究，并取得了新的成果。同时，又陆续发现了一些新的有效穴位，使腧穴学得到不断的充实和提高。