标本配穴预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤炎症因子的调控机制
糖尿病是一类由于胰岛素分泌相对或绝对不足导致的代谢紊乱性疾病,以血糖血脂明显增高为特征。大量流行病学和临床研究表明,糖尿病的心血管并发症正逐步成为其主要并发症[1],其发病率逐年上升,病死率已超过单纯心血管疾病病死率1～2倍,且心肌受损严重、预后差[2,3]。心肌缺血再灌注损伤的形成机制研究涉及炎性反应、线粒体的损伤、细胞凋亡和微血栓的形成等多个方面[4,5,6]。其中,炎症细胞因子的过度释放及炎症反应的增强是导致心肌缺血再灌注损伤的重要因素,并贯穿损伤的全过程[7,8,9]。各种预处理方式尤其是电针预处理是一种有效对抗心肌缺血再灌注损伤的内源性心肌保护措施[10],然而关于标本配穴预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤炎症因子的调控作用尚未明确。通过建立糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,本研究旨在观察标本配穴预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌组织炎性细胞因子的影响,并探讨其可能的作用机制。
材料与方法
1. 动物
采用3月龄SPF级雄性Wistar大鼠50只,体质量(220±28)g,由湖北省医学科学研究院实验动物中心提供,动物喂养于标准动物房,大鼠适应性喂养1周开始实验,动物许可证号:SCXK(鄂)2008-0005,实验动物质量合格证号:42000600006844。
2. 仪器及试剂
艾科浦超纯水制成机(型号:AD3L-05-03-CE,艾科浦国际有限公司,美国),华佗牌0.30mm×15mm牌无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司),ALC-V8S小动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司),Gc-911放射免疫γ计数器(中国科技大学中佳公司),移液器(Eppendofr,德国),台式离心机(上海精密仪器仪表厂),IL-1β、IL-6、IL-10酶联免疫吸附测定试剂盒(北京莱博特利生物医学科技有限公司),特异性阻断剂SB203580(美国selleck生物科技有限公司),链脲佐菌素(STZ,购自美国Sigma公司),医用75%乙醇(武汉兴和达商贸有限公司),无菌0.9%氯化钠溶液(国药集团化学试剂有限公司)。
3. 动物分组及处理方法
采用随机数字表法,将50只大鼠分为5组:即糖尿病假手术组(diabetes shame operation group,DS组)、糖尿病缺血再灌注组(diabetes model group,DMI组)、糖尿病电针预处理组(diabetes electroacupuncture pretreatment group,DEA组)、糖尿病电针+抑制剂预处理组(diabetes electroacupuncture pretreatment+SB203580 group,DEA+DSB组)、糖尿病抑制剂预处理组(diabetes SB203580 group,DSB组)。糖尿病假手术组:10只,捆绑1次/d,20min/次,共7d,第8天开胸后暴露心脏不做其它处理;糖尿病缺血再灌注组:10只,捆绑1次/d,20min/次,共7d,第8天开胸后缺血20min,再灌注40min;糖尿病电针预处理组:10只,大鼠穿自制鼠衣,参照《大鼠穴位图谱的研制》[11]取穴,取双侧内关(PC6)和足三里(ST36),用0.30mm×15mm毫针针刺双侧穴位,针刺深度约5mm,接HANS-200电针治疗仪,选用连续波,频率2Hz,强度为1mA,通电20min,1次/d,共7d,第8天行缺血再灌注术;糖尿病电针预处理+抑制剂处理组:10只,电针预处理7d,第8天在缺血再灌注前给予抑制剂处理;糖尿病抑制剂处理组:10只,捆绑1次/d,20min/次,共7d,第8天抑制剂SB203580溶于二甲基亚砜成20%溶液,在缺血再灌注前给予0.3mg·kg-1·d-1皮下注射[12]。
4. 造模
采用S T Z腹腔注射法(即腹腔注射S T Z65mg/kg)[13],72h后空腹血糖值>16.7mmol/L,并出现多饮、多食、多尿。成功后在体心肌缺血再灌注损伤模型,采用推管法行左冠状动脉缺血再灌注术[14,15],用3%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔内注射进行麻醉,起效后将大鼠置于鼠台上固定,心电监测。将大鼠颈部皮肤切开,暴露气管,于气管软骨环处做“T”型切口,插导管,接入呼吸机(f 50次/min,I/E 1∶1.5,Plimit 20cm H2O)。左侧胸骨第3、4肋间横切口切开皮肤,用止血钳钝性分离各肌层及胸膜并撑开,剪开心包膜,暴露心脏,在左心耳下2～3mm处用2×6带线圆针6-0号医用锦纶单丝线绕过前降支冠状动脉,肺动脉圆锥旁沟出针,于丝线上方垫一PE管,打活结造成缺血模型,并采用推管法行左冠状动脉缺血再灌注术。以左室前壁向外膨胀及心电ST段抬高为缺血标志;再灌注时左室前壁缺血区紫色消失,抬高的ST段下降1/2以上,局部反应性充血,有炎性水肿和渗出,即缺血再灌注模型制备成功。
5. 指标检测
5.1 各组大鼠心肌组织IL-6、IL-1β、IL-10含量的测定
将手术器械预先放置于4℃冰箱中预冷。造模成功后,用10%水合氯醛(0.28g/kg)进行腹腔内注射麻醉,切取心脏相应心尖区组织(50～80mg),0.9%氯化钠溶液漂洗,洗净血液,滤纸拭干,电子天平称取重量,试管中制备10%组织匀浆,用眼科剪剪碎组织块,4℃,3 500r/min离心15min。取上清液,制备组织匀浆。
5.2 各组大鼠心肌组织内SOD活性、MDA含量测定
实验结束后处死动物,取左室前壁心肌0.6～0.8g置入-80℃深低温冰箱保存。用超声匀浆器打碎匀浆,3 500r/min离心15min后取上清液,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)用黄嘌呤氧化酶法测定,丙二醛(malondialdehvde,MDA)采用TBA法测定。
5.3 心肌组织超微结构观察
将心肌组织放置于由2.5%戊二醛、磷酸缓冲液配制的试剂中漂洗后使其固定3h,再实施脱水、包埋、固化、超薄切片步骤,后采用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色,在透射电镜下观察心肌细胞结构。
6. 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件对数据进行处理分析,数据均以±s表示,组内比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.各组大鼠心肌组织IL-6、IL-1β、IL-10含量的比较
见图1。与DS组比较,DMI组、DSB组、DEA组和DEA+SB组的IL-6、IL-1β和IL-10均显著升高(P<0.05)。DEA组、DEA+DSB组、DSB组的IL-6和IL-1β较DMI组显著降低(P<0.05)。DEA组、DEA+DSB组和DSB组的IL-10较DMI组显著升高(P<0.05)。
2.各组大鼠心肌组织内SOD活性、MDA含量比较
见图2。与DS组比较,DMI组大鼠心肌SOD含量显著降低(P<0.05),MDA含量显著升高(P<0.05);与DMI组比较,DEA组、DEA+DSB组和DSB组的大鼠心肌SOD含量显著上升(P<0.05),MDA含量显著降低(P<0.05)。
3.心肌组织超微结构观察
见图3。DS组心肌肌纤维组织排列规则且结构完整,细胞核和线粒体形态、数量均正常,线粒体嵴清晰,心肌间未见异常。而DMI组心肌肌纤维溶解断裂,严重时呈坏死,其间质增大并有显著的肿胀。线粒体嵴不清晰或断裂成絮状、缺失。DEA组及DEA+DSB组心肌肌纤维间隙增宽较小,心肌细胞肿胀减轻且坏死灶改善,细胞核和线粒体结构较为完整,较少线粒体仍有空泡样病变。
讨论
糖尿病是以发病率高、并发症多、致残率高为特点的一类慢性代谢性疾病。临床研究显示,糖尿病患者的心脏对缺血再灌注损伤更敏感,导致术后死亡率高于非糖尿病患者[16]。预处理是通过人为采用一些方法激发机体的内在抗病能力,以利于疾病预防或减轻随后疾病损害的方法,充分重视机体自身潜力,符合中医“未病先防”的“治未病”理念,即《素问·四气调神大论》所云:“圣人不治已病治未病,不治已乱治未乱,此之谓也”。而早在《素问·刺热论》中就有:“病虽未发,见赤色者刺之,名曰治未病”。以上均表明在“顺应天时”和“见微知著”的理论基础上,通过针刺预处理等方式治疗疾病,能够以治为防,充分发挥治疗效果。Murry C F等[17]研究表明,缺血预处理可保护心脏免受随后的持续性缺血性损伤,并提高心肌对缺血的耐受性,这也与上述论述相符。
本研究遵循中医针灸“治未病”理论,在“标本配穴”的指导下,选取固护正气、祛除邪气的穴位内关、足三里,从而达到防治疾病的目的。所谓标本配穴法,是指以固护正气的腧穴为本,以祛除邪气的腧穴为标,两者配合应用的腧穴配伍方法[18]。中医发病学理论提出:“正气存内,邪不可干”。强调人体正气在疾病发生中的重要作用,因此在治疗中要注重鼓舞人体正气,达到扶正祛邪的效果。心肌缺血属于中医“胸痹心痛”范畴,基本病机为本虚标实,预处理穴位选取内关、足三里。内关穴为心包经络穴,又通阴维脉,正如《八脉交会八穴歌》中说:“内关阴维下总同”,内关为八脉交会穴,善治心胸疾病。又有《灵枢·经脉》曰:“手心主之别,名曰内关……实则心痛,虚则为头强,取之两筋间也”。《针灸资生经》云:“凡心实者,心中暴痛,虚则心烦惕惕然,内关主之”。进一步详述了内关在治疗心系疾病如心痛、心悸等方面发挥了重要作用。足三里穴,属足阳明胃经腧穴,有生发胃气的功效,且经别上通于心,能宣痹通阳,《针灸真髓》云:“三里养先后天之气,灸三里可使元气不衰,故称长寿之灸”。表明足三里可以健脾和胃,鼓舞气血,升提正气,为强壮保健、防病治病之要穴。也有相关研究指出,针刺“足三里”和“内关”可增强心肌缺血大鼠抗氧化能力[19],与上述论述相符。此外,实验研究证明,标本配穴预处理可调节糖尿病及其并发症,改善内分泌和胰岛素敏感性[20,21],并可改善慢性心肌缺血大鼠心率、ST段电压变化,减轻心肌组织病理损伤,对慢性心肌缺血的保护作用不容忽视[22,23,24]。两穴合用,共奏宣痹通阳、培元固本之功效,以预防胸痹心痛的发生,从而扶正祛邪。本研究结果发现,标本配穴预处理可以明显提高心肌组织SOD的含量,降低MDA的含量,即标本配穴预处理可减轻心肌缺血再灌注对心肌细胞结构的破坏,改善线粒体的呼吸功能,对线粒体的结构与功能发挥了良性的保护效应[25],从而与中医“治未病”理念相符。
再灌注时突然恢复缺血会引发大量中性粒细胞从循环血液中进入缺血组织,导致急性炎性反应。心肌结构会因为炎性细胞的激活和释放而发生改变,调控炎性细胞的释放和活性能够有效防治心脏疾病[26,27]。研究表明[28],炎性因子会因为在应激性高糖状态下加剧的炎性反应而大量增加,随后激活炎性应答因子,血液中IL-1、IL-10等炎性因子随之增加,导致心肌细胞损伤严重。且炎症介质IL-6、IL-1β等物质,可相互之间为一组,产生彼此拮抗的作用,并保持内环境的稳态,IL-6的大量释放会使炎症反应加剧,并介导免疫反应[29]。本研究结果显示,除假手术组外,针刺预处理可通过降低IL-6、IL-1β的表达以减轻糖尿病大鼠的炎症反应;而与DS组、DMI组比较,其他组IL-10含量均升高,说明针刺预处理能够激活内源性的抗炎因子,从而对受损心肌细胞发挥保护作用。
电镜下观察到,DEA组及DEA+DSB组心肌肌纤维间隙增宽较小,心肌细胞肿胀减轻且坏死灶改善。且SB203580可抑制离子通道对心肌的保护作用,SB203580可减轻心肌缺血模型大鼠线粒体膜的去极化和肿胀程度,通过保护线粒体结构和功能的完整性来防治心肌缺血,这也说明DEA组和DEA+DSB组均可以减轻心肌损伤,有效保护心肌肌纤维组织,改善间质肿胀。
综上所述,本研究通过建立糖尿病大鼠模型证实,标本配穴预处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤具有良性保护效应,并能调控炎症细胞因子IL-6、IL-1β和IL-10的表达,从而减轻炎症反应和心肌损伤,其作用机制可能与抑制炎症反应的发生相关。
来源：中华中医药杂志 作者：宋燕娟 梁凤霞 陈松 王华 吴松 陈茜