艾灸干预胃溃疡大鼠胃黏膜脑肠肽的动态表达
胃溃疡是消化系统常见疾病, 经过临床及基础研究发现艾灸对胃溃疡能起到较好疗效[1,2]。研究表明, 艾灸能调节脑肠肽水平, 降低胃黏膜溃疡指数及增加胃黏膜血流量, 起到保护胃黏膜、促进胃黏膜损伤修复的作用[3,4,5]。但艾灸治疗胃溃疡的时效关系研究较少。本研究采用病理形态学及分子生物学方法, 探究艾灸干预胃溃疡的时效关系。
材料与方法
1. 动物与分组
普通级雄性7周龄SD大鼠72只, 180～220g, 购自吴氏实验动物中心, 许可证号:SCXK (浙) 160803004, 分笼饲养于厦门大学医学院中医系动物房, 自然照明, 自由饮食。适应环境1周后, 按每批24只分为3批, 每批根据随机数字表法随机分为正常组、模型组、胃经穴位组、非经穴位组、每组6只。
2. 试剂与仪器
70%乙醇、水合氯醛、多聚甲醛 (上海国药, 生产批号分别为:10009259、30037516、80096618) 。TaKaRa LA Taq®试剂盒[Takara, 型号:RR02MB (A×4) ];Trans2K DNA Marker (TransGen Biotech, 型号:BM101-02) ;艾条 (南阳汉医, 规格:0.6cm×1.5cm) 。PCR反应扩增仪 (ABI, 型号:7900HT) ;移液器 (Gilson, 型号:Pipetman P) ;微量分光光度计 (Thermo, 型号:Nanodrop 2000c) ;离心机 (Eppendorf, 型号:5424R) ;病理切片机 (Leica, 型号:CM1850) 。
3. 大鼠模型建立
动物造模前, 将大鼠禁食不禁水24h, 后除正常组外各组大鼠一次性给予70%乙醇灌胃 (4mL/kg) , 正常组给予等量纯净水[6]。
4. 干预方法
胃经穴位组和非经穴位组大鼠捆绑于鼠板, 用特定的动物艾条艾灸, 30min/d, 3批大鼠分别连续干预时间为1、4、7d。胃经穴位组选取“梁门”及“足三里”, 非经穴位组选取“梁门”及“足三里”外旁开5mm处。正常组及模型组捆绑于鼠板30min/d, 不予干预措施, 至本批次实验干预结束。
5. 标本采集与处理
采集标本之前, 各组大鼠均禁食不禁水24h, 称量大鼠体质量, 将10%水合氯醛腹腔注射麻醉 (0.35mL/100g) [7], 取出胃部, 用0.9%氯化钠溶液清洗, 后切取胃窦部放置于-80℃冰箱中保存, 以备检测使用。
6. 指标检测
6.1 胃黏膜病理学观察
从样本中取出胃组织, 切取胃窦部位约0.5cm×0.5cm用0.9%氯化钠溶液洗净, 放入4%多聚甲醛溶液中固定处理48h, 常规石蜡包埋, 苏木素-伊红染色, 于光镜下观察胃黏膜病理形态。
6.2 RT-PCR检测
从上述备用组织中剪取0.5cm×0.5cm, 将0.1moL/L冰PBS缓冲液加入放置组织碎块的移液管中 (组织块重量∶缓冲液体积=1∶9) , 并采用匀浆机于冰块上进行匀浆 (10 000r/min) , 将匀浆液移入洁净的离心管中, 以4℃3 000r/min离心15min。提取上清液, 转移至洁净的EP管中。
利用Trizol法提取总RNA并取1μg反转录成c DNA。其扩增条件为:94℃1min预变性;94℃30s, 60℃30s, 72℃30s, 72℃1min, 共40个循环。扩增循环之后导出CT值, 并使用2-ΔΔCT值计算方法分析增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 和P物质 (substance P, SP) 的mRNA相对表达量。
7. 统计学方法
所有数值用±s表示, 通过SPSS 17.0软件分析数据, 检验各组数据是否呈正态分布, 若满足正态分布且方差齐时采用单因素方差分析LSD法, 方差不齐时选择Dunnett T3法进行方差检验, 同时选择两两比较;若不满足正态分布, 则使用秩和检验。P<0.05为差异具有统计学意义。
结果
1.各组大鼠胃黏膜病理学观察
见图1-图3。各正常组胃黏膜上皮形态结构完整, 上皮细胞排列整齐且上皮细胞形态完整, 未见溃疡性损害。 (1) 干预1d后, 模型组、胃经穴位组及非经穴位组可肉眼观察到胃黏膜明显充血潮红, 胃体处可见多处溃疡灶, 并可见明显出血点, 胃黏膜层破坏, 胃黏膜下可见上皮细胞排列不整且出现细胞水肿。 (2) 干预4d后, 模型组与非经穴位组的胃黏膜仍可见溃疡性损害, 上皮细胞排列不整, 胃经穴位组大鼠胃黏膜可见少量上皮细胞排列不整, 细胞充水状态有所改善。 (3) 干预7d后, 模型组胃黏膜未见溃疡性损害, 少量细胞存在充水状态, 胃经穴位组与非经穴位组黏膜形态基本完整, 上皮细胞排列基本整齐, 仅有少部分细胞存在充水状态。
图1 艾灸1d大鼠胃黏膜病理情况 (HE×400)
注:N.正常组;M.模型组;A.胃经穴位组;B.非经穴位组。下图同。
图2 艾灸4d大鼠胃黏膜病理情况 (HE×400)
图3 艾灸7d大鼠胃黏膜病理情况 (HE×400)
2.各组大鼠胃黏膜PCNA和SP表达
见表1-表2。干预1d后, 与正常组比较, 模型组的胃黏膜PCNA表达显著降低 (P<0.05) , SP表达显著升高 (P<0.05) ;与模型组比较, 胃经穴位组和非经穴位组PCNA表达显著升高 (P<0.05) , SP无显著差异;与非经穴位组比较, 胃经穴位组的PCNA显著升高 (P<0.05) , SP无显著差异, 说明艾灸1d胃经穴位更能提高PCNA表达量。
表1 各组大鼠胃黏膜PCNA相对表达量 (±s, n=6)
注:与正常组同期比较, *P<0.0 5;与模型组同期比较, △P<0.05;与非经穴位组同期比较, ▲P<0.05;与同组干预1d时比较, □P<0.05;与同组干预4d时比较, ■P<0.05。下表同。
表2 各组大鼠胃黏膜SP相对表达量 (±s, n=6)
干预4d后, 与正常组比较, 模型组的胃黏膜PCNA表达显著降低 (P<0.05) , SP表达显著升高 (P<0.05) , 胃经穴位组的胃黏膜SP表达无明显差异;与模型组比较, 胃经穴位组和非经穴位组PCNA表达显著升高 (P<0.05) , SP表达量显著降低 (P<0.05) ;与非经穴位组比较, 胃经穴位组的PCNA显著升高 (P<0.05) , SP表达显著降低 (P<0.05) 。
干预7d后, 各组大鼠胃黏膜PCNA及SP表达量均无显著差异。说明艾灸7d后大鼠PCNA及SP已基本恢复正常水平。
与同组干预1d时比较, 干预4d时胃经穴位组PCNA的相对表达量显著升高 (P<0.05) , 胃经穴位组和非经穴位组的SP相对表达量显著降低 (P<0.05) ;与同组干预4d时比较, 干预7d时胃经穴位组和非经穴位组PCNA及SP的相对表达量均显著降低 (P<0.05) 。
讨论
胃溃疡是诱发多种胃部疾病的起始环节, 现代医学认为主要是胃酸、胃蛋白酶、幽门螺杆菌等与胃黏膜的免疫屏障失衡有关[8]。本课题组的前期研究表明, 艾灸能有效促进胃黏膜损伤的修复[9,10]。根据大量的实验报道, 胃溃疡大鼠可通过调节自身的免疫系统以促进溃疡的愈合[11]。
PCNA是参与细胞周期调节的一种蛋白, 与细胞修复、增殖有着密切的联系, 可反应细胞增殖的情况[12,13]。在胃溃疡中PCNA表达升高可反应胃黏膜处于修复阶段。SP属于促炎性感觉性神经肽类, 多处于胃肠道与神经系统之中[14], SP表达量增加可反应神经焦虑及疼痛发生[15,16]。大鼠胃黏膜的溃疡面可刺激胃壁神经, 增强疼痛感。PCNA和SP因能有效反应胃肠功能状态, 因此在基础研究领域被广泛应用。
在本实验中, 发现大鼠在胃溃疡造模1d后, 胃黏膜上皮细胞增殖减少, 焦虑感和疼痛感提升, 艾灸1d后能明显促进胃黏膜上皮细胞增殖, 加速胃黏膜损伤修复, 其中艾灸干预胃经穴位较非经穴位改善更加明显, 然而对焦虑感和疼痛感并无明显改善。干预4d后, 胃黏膜上皮细胞增殖较干预1d后显著提升, 能显著降低疼痛以及焦虑感, 并且艾灸干预胃经穴位较非经穴位改善更加明显。干预7d后, 模型组、胃经穴位组与非经穴位组的胃黏膜上皮细胞增殖水平以及疼痛焦虑感同正常组无显著差异。结合病理图片表明, 胃溃疡大鼠胃黏膜经艾灸干预4d后胃黏膜形态较模型组有所改善, 7d时基本自愈恢复正常。
综合本实验结果, 艾灸“足三里”及“梁门”干预胃溃疡1d与4d后对胃黏膜细胞的增殖和修复具有显著疗效, 4d后对降低疼痛焦虑感有显著疗效, 且大鼠胃黏膜于7d病理形态、胃黏膜细胞增殖情况及焦虑疼痛感基本自愈恢复正常。本实验为艾灸干预胃溃疡大鼠的时效关系进行初步探究, 为后续艾灸治疗胃溃疡的研究提供实验依据。
来源：中国民间疗法 作者：何其达 刘密 连林宇 张媛 沈佳成 刘彩春 黄妙森 张珑滨 钱林超 常小荣 杨宗保